近日，Chinese Medical Journal 雜志在線發(fā)表了艾米森與北京大學第一醫(yī)院李學松教授團隊合作發(fā)表的名為“An accurate diagnostic approach for urothelial carcinomas based on novel dual methylated DNA markers in small-volume urine”的文章，介紹了一種基于不到2毫升尿液的以新型雙靶標為檢測靶點，可同時檢測膀胱癌、腎盂癌和輸尿管癌這三種尿路上皮癌的新技術。

當前尿路上皮癌的診斷方法大多是有創(chuàng)的或者準確性不高，尿液中脫落細胞DNA或者cfDNA 在尿路上皮癌診斷中表現(xiàn)出巨大的潛力。尿路上皮癌包括下尿路上皮癌（主要是膀胱癌）和上尿路上皮癌（包括腎盂癌和輸尿管癌）。當前尿液DNA甲基化診斷標記物絕大多數(shù)是針對膀胱癌，尿路上皮癌的通用標記物很少。另外，現(xiàn)有的尿液DNA甲基化檢測技術大多基于大體積尿液（數(shù)十毫升）。本項目在前期研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)了一個全新的尿路上皮癌通用標記物AL021918.2， 并將其與VIM組成了雙靶標Panel，在基于1.8mL的檢測體系中，該Panel對尿路上皮癌的檢測敏感性和特異性均在90%以上。

該研究使用窗口滑動算法分析TCGA數(shù)據(jù)庫里的膀胱癌組織樣本和癌旁組織樣本之間的差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions (DMRs)），用ROC曲線分析每個DMR的甲基化水平對TCGA中膀胱癌和癌旁樣本的區(qū)分能力，根據(jù)兩個標準篩選Top DMR，標準1為：特異性大于95%，敏感性排名前20；標準2為：特異性大于90%，敏感性排名前5。

其次，從25個標記物中選取8個在30例健康血細胞樣本和20例健康人尿液樣本中進行Sanger 測序，剔除在10%以上的健康樣本中出現(xiàn)甲基化位點的DMR，將剩余DMR在47例膀胱癌組織，14例輸尿管癌及其配對的癌旁組織和14例腎盂癌及其配對的癌旁組織中進行甲基化特異性PCR驗證，最終確定了敏感性和特異性最優(yōu)的甲基化標記物—AL021918.2（下圖1）。

圖1.各個標記物在組織樣本中的甲基化特異性PCR結果分析

其中NAT表示癌旁正常組織，LG-UTUC表示低級別上尿路上皮癌，HG-UTUC表示高級別上尿路上皮癌，LG-BCa表示低級別膀胱癌，HG-BCa表示高級別膀胱癌。

最后，將AL021918.2和其他甲基化標記物在477例尿液樣本中進行甲基化特異性PCR驗證，尿液樣本包括199例膀胱癌、39例腎盂癌、26例輸尿管癌和213例陰性/干擾樣本（良性疾病樣本、良性腫瘤樣本和其他泌尿系癌癥樣本）。PCR分析結果如下圖2所示。在所有樣本中單獨分析一個標記物時，AL021918.2的ROC曲線下面積值（AUC值）、敏感性和特異性均最高，分別為0.94、87.12%和93.90%；當兩個標記物組合時，AL021918.2和VIM的組合檢測準確性最高，AUC值、敏感性和特異性分別為0.96、93.94%和92.02%。另外，兩個基因組合對低級別膀胱癌、低級別上尿路上皮癌、Ta期尿路上皮癌的敏感性均在90%以上，分別為91.11%、100%和94.44%。

圖2. 尿液甲基化特異性PCR檢測結果分析

其中M25代表AL021918.2；PUNLMP表示低度惡性潛能乳頭狀瘤；LG表示低級別；HG表示高級別；KIRP表示腎乳頭狀細胞癌；KIRC表示腎透明細胞癌。

AL021918.2與VIM的組合可達到超過90%的整體準確度。我們的診斷標記物的總體特異性為92.02%，與細胞學檢查特異性相當，其對低級別和早期癌的敏感性也都高于90%。最重要的是，該標記物組合在診斷上尿路上皮癌方面表現(xiàn)優(yōu)異，而上尿路上皮癌易被傳統(tǒng)的細胞學和熒光原位雜交漏檢。

上述優(yōu)點將有助于醫(yī)務人員在多種臨床場景下做出決策。例如，該診斷工具可用于血尿人群的風險分層，從而可以減少內(nèi)鏡檢查的工作量。此外，將這樣準確的非侵入性方法與影像學方法結合使用時，可以幫助確認或排除有無上尿路上皮癌的存在。此外，該分子尿液檢測陽性后，再使用更敏感的窄帶成像或光動力學做確診，可以降低傳統(tǒng)白光鏡帶來的假陰性。因此，這種簡單有效的診斷檢測方法具有廣闊的臨床應用前景。